泛素特异性蛋白酶18在HBV慢性感染及干扰素抵抗中的作用机制

干扰素(interferon，IFN)α在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治疗中的优势为有限疗程和相对较高的HBeAg和HBsAg的血清学转换率，但是其疗效尚不尽人意。

在造成IFN应答不佳的众多影响因素中，IFN抗病毒作用信号通路尤其是对IFN刺激基因(interferon stimulated gene，ISG)的研究逐渐成为热点，其中ISG15和泛素特异性蛋白酶18 (ubiquitin-specific protease18，USPl8)在HBV逃避天然免疫和IFN抵抗方面发挥着重要作用，新近研究结果显示USP18对IFNd在CHB抗病毒疗效方面可能具有预测作用。

一、ISG15/USP18概述

ISG15是受IFN、病毒感染、细菌脂多糖等刺激后可高水平表达的一种小分子类泛素蛋白质，分子量约为1.5×1 04，主要由人类的单核细胞、淋巴细胞分泌，以游离态或结合态存在。

游离态的ISG15可活化CD56+自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞、刺激IFNy的产生、促进树突状细胞的成熟以及中性粒细胞的募集，以细胞因子的作用调节免疫反应。

结合态ISGl5经特异性蛋白酶剪切加工后暴露其与泛素结构相似的分别位于两端的蛋白质结合的核心序列一双甘氨酸序列(LRLRGG)，与目标蛋白质结合形成泛索样共价结合修饰(ISGvlation)，此过程与泛素的激活相似，同样需要激活酶E1、结合酶E2和lSG15连接酶E3组成类似于泛素化过程的级联酶系，研究结果显示IFN可诱导上述3种酶的高表达。

研究者应用双亲和力选择法及质谱分析鉴定了158种ISG15靶蛋白，其中很多是IFN反应中的重要组分，包括酪氨酸激酶(janus kinases，JAK)l、信号转导子与转录激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)1、维甲酸诱导I型基因(retinoicacid inducible gene I，RIG-I)蛋白、抗病毒因子蛋白黏液病毒蛋白A(myxovirus protein A，MxA)、蛋白激酶R和2’，5’一寡腺苷酸合成酶，ISG15修饰这些目标蛋白质并不能直接介导降解，而是通过竞争性结合共价修饰目标蛋白质来拮抗体内泛素化过程免以泛素蛋白酶系的降解，进而参与机体多种生物学过程的调节。

目前认为USP18是唯一体外被证明的ISG15特异性水解酶，属于泛素特异性降解酶家族，位于细胞核内，在肝脏、胸腺和单核巨噬细胞中高度表达。

USPl8基因的转录启动子位于IFN刺激应答反应元件内，故IFN可以诱发机体强烈表达USP18，其相对分子质量约为4.3×104，故又称作UBP43，它含有一段高度保守短序列一半胱氨酸残基（半胱氨酸盒）和组氨酸残基（组氨酸盒），该段序列是USPl8的活性中心，它能够从ISGylation的蛋白结合物中移出ISGl5阻碍ISGl5的生物学效应，发挥其蛋白酶依赖性作用，但是USP18并不水解破坏游离的ISG15分子。

另外USP18还具有非蛋白酶依赖性作用，通过竞争性结合IFN受体而抑制IFN的抗病毒作用。

二、ISGl5/USP18与HBV感染慢性化的关系

机体抗病毒免疫功能及病毒逃避免疫攻击的能力决定着HBV感染的发生、发展和转归。“诡异”的双链DNA HBV感染人体后将其复制模板共价闭台环状DNA隐藏于肝细胞核中，不易被位于细胞膜或细胞内体上的Toll样受体(ToIl like receptor．TLR)和位于细胞质内的全反式RIG-I和黑色素瘤分化相关基因5等模式识别受体识别激发天然免疫。

HBV作为细胞内复制的DNA病毒，细胞质中的双链DNA可通过位于胞质的DNA依赖IFN调节因子受体激活物、IFN诱导核蛋白16以及RIG-I等模式识别受体识别，DNA依赖IFN调节因子受体激活物、IFN诱导核蛋白16和RIG-I识别胞质DNA招募TBKI和IRF3，通过TBK和IFN基因活化物活化IRF3，使其发生核转位诱导I-IFN的产生。

IFN诱导核蛋白16蛋白含有核定位信号肽，不仅能够识别胞质双链DNA也能够识别细胞核内双链DNA，IFN诱导核蛋白16蛋白识别胞核内双链DNA通过IFN基因活化物活化IRF7，使其发生核转位，同样诱导I-IFN与炎症性细胞因子激发天然免疫。

通过研究CHB患者外周血淋巴细胞的TLR表达及其功能，发现TLRl/2/4/6表达低下，相应配体刺激后免疫细胞分泌细胞因子减少，并与血中存在病毒表面抗原有关，提示HBV感染能够干扰TLR信号传导通路的活化。

进一步研究发现CHB患者外周血单个核细胞和浆细胞样树突状细胞经TLR7/9配体介导产生IFN α的能力显著低于健康对照者。采集CHB、急性乙型肝炎及健康对照者外周血单个核细胞来源的树突状细胞，给予水泡性口炎病毒刺激16 h，与健康对照组相比，CHB组患者RIG-1表达减少50%，急性乙型肝炎组患者减少70%，同时CHB组患者IFN β表达量减少了20%。

应用HBV转染的HepG2.2. 15细胞株培养发现其IFN p表达较未转染HBV的细胞株明显受抑制，转染RIG-l后IFN β表达量增加，提示HBV感染CHB患者树突状细胞中RIG-I-IFN β信号通路受影响。应用免疫沉淀及质谱分析方法研究发现细胞质中HBx的结合蛋白是RIG一l-IFN β信号通路中的接头蛋白IFN启动子刺激因子-1。

应用细胞转染技术研究结果显示HBx以剂量依赖的方式抑制双链DNA调节的IFN β信号活化，表明HBV通过HBx干扰RIG-l通路影响天然免疫。体外实验结果显示，HBV感染肝细胞内堆积的大量核心蛋白通过与IFN刺激应答反应元件序列的MxA启动子结合抑制其基因转录。

Yu等发现HBV多聚酶基因表达区域含有STATl结合位点，应用瞬时转染技术发现HBV多聚酶以剂量依赖方式抑制仙台病毒及聚肌胞诱发的IFN-β启动子活化，同时发现HBV多聚酶抑制IRF-3磷酸化、二聚体化以及核转位，干扰多种ISG相关目的基因启动子转录，减少IFN诱导蛋白MyD88等表达，强烈抑制IFNα的抗病毒活性。

Christen等发现HBV可引起蛋白磷酸酶2A的表达明显增强，导致STATl的第31位精氨酸的甲基化降低，减弱STATl-DNA的结合能力，抑制了内源性IFN的下游信号传导和生物学作用。将有活性复制能力的HBV DNA经尾静脉高压注射人小鼠体内建立HBV复制体系，基因敲除ISG15的连接酶成分对HBV复制无明显影响，而USPl8基因敲除小鼠体内HBV复制水平平稳下降，应用短发夹干扰USP18也得出同样的结果，表明USP18表达减少有助于清除HBV。

USPl8缺陷细胞高水平表达ISG-15修饰蛋白，更重要的是USP18缺乏通过延长STAT1磷酸化，增强上百种ISG相关基因表达强化了IFN的敏感性。总之，HBV通过拮抗模式识别受体识别及其下游信号通路，同时激发天然免疫产生I-IFN激活IFN信号通路而产生USP18等抑制性ISG产物干扰IFN信号通路等多水平的逃逸机制而逃避宿主的抗病毒活性，保持其在肝细胞中的复制，造成宿主的慢性持续性感染。

三、USPl8在CHB IFN抵抗中的作用

IFN α具有抗病毒、抗增殖、免疫调节作用，是防御微生物尤其是病毒感染，参与人体，天然免疫应笞必不可少的成分。IFN通过结合异二聚体化干扰素α受体（interferon alpha receptor，IFNAR）1/2，改变受体在细胞内的构象，并进一步激活酪氨酸激酶JAK和STAT，使STATI/2同聚或异二聚体化，核内转运，募集IFN应答因子9，组成IFN刺激基因因子3，IFN刺激基因因子3的异质三联体与IFN刺激应答反应元件结合，启动IFN刺激基因的转录，翻译成具有直接或间接抗病毒作用的蛋白，如ISG15、USP18、PKR.2^，，5’寡腺苷酸合成酶、核糖核酸酶、MxA蛋白以及RIG-I蛋白等，参与天然免疫应答，并辅助获得性免疫应答，控制或清除微生物感染，此过程即经典JAK-STAT信号途径。

Malakhova等应用生物化学和基因方法进一步研究发现USP18通过非ISG15蛋白酶途径与IFNAR2的近膜区域Box1Box-2基因序列结合，竞争性抑制IFNAR2与JAKl的结合，抑制JAK和STAT的磷酸化进而抑制JAK-STAT的下游反应，下调I型IFN信号途径的抗病毒作用。

Franoois-Newton等进一步研究发现USP18不影响IFNAR2的基础表达水平，而是通过竞争性结合受体，阻碍受体与相应配体的结合。研究结果显示IFN β与IFNα结合相同的受体，但IFN β与IFNAR具有较强的亲和力，故USP18对IFN β信号通路的抑制作用不是很明显，低水平的IFN β也可以激活STAT的磷酸化，启动抗病毒通路。

研究发现缺失USPl8基因的大鼠可以抵抗由于多种病毒感染造成的细胞病变效应，其中包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、口腔疱疹病毒(vsv)、辛德毕斯病毒及HBV等。Fan等在HepG2.2. 15细胞中应用小干扰RNA沉默USP18，并给予IFN刺激，细胞中的HBeAg滴度和HBV DNA水平明显下降，表明沉默USPl8会增强IFN抑制HBV复制的作用。

研究发现敲除USP18基因的小鼠对IFN高度敏感，抗HBV蛋白的表达水平明显增加。Xiao等通过比对7例IFN无应答和6例应答CHB患者治疗前肝组织基因发现，包括ISG和免疫相关基因在内的3592个基因表达不同，无应答组包括USPl8在内的ISG基因高表达而免疫相关基因表达受抑制，表明在IFN治疗前CHB患者体内由于HBV感染刺激产生的内源性IFN预先激活了IFN信号途径，增强表达了USPl8等抑制性ISG相关基因，USP18通过发挥非蛋白酶负性调节作用，抑制IFN抗病毒信号的传导，导致下游信号抗病毒蛋白的表达受限，进而不能有效地抑制HBV复制，影响IFN的抗病毒疗效。

Chen等应用实时定量PCR检测IFN治疗前无应答患者及应答患者肝组织中的预测基因的表达水平，发现ISGl5/USP18可以作为负性调节因素预测IFN治疗慢性丙型肝炎的疗效。进一步通过免疫组化研究发现在无应答患者肝细胞中ISG15的表达增强，而在有应答患者的枯否细胞中ISG15表达上调。

Zhu等通过对IFN治疗前CHB患者肝组织免疫组化发现，无应答组ISG15和MxA蛋白于肝细胞内高表达而应答组主要表达于Kupfer细胞内，表明ISG15和MxA蛋白表达的细胞特异性和IFN信号途径的预激活与CHB患者IFN应答疗效相关。

通过对应用Peg-IFN α 2b的16例慢性丙型肝炎患者治疗前及治疗后4h的肝穿组织研究发现，取得快速病毒学应答患者注射IFN后STATI的核转位主要发生在肝细胞，而非快速病毒学应答患者的STATI核转位发生在枯否细胞中，并且非快速病毒学应答患者于IFN治疗前的肝细胞核中已经存在磷酸化的STAT1，表明治疗前IFN的JAK-STAT信号途径已经被预激活。

非快速病毒学应答患者在IFN治疗前肝组织中高水平表达ISGs，治疗后ISGs的表达水平无明显增加，而产生快速病毒学应答患者治疗前肝组织中ISGs呈低水平表达，治疗后ISGs的表达快速增加，表明治疗前肝组织中无IFN预激活的患者给予外源性IFN治疗后可迅速产生抗病毒效应。

研究结果显示慢性丙型肝炎患者非快速病毒学应答患者治疗前肝组织中高水平表达USP18，治疗后USPl8的表达水平无明显增加。Sarasin-Filipowicz等反复注射IFNα使得大鼠肝细胞对进一步的IFN刺激变得不敏感，并且在基因和蛋白水平上发现USP18是导致产生IFN再刺激持续不敏感的关键因素。

Randall等在体外应用小干扰RNA使USPl8表达沉默，使得IFNa对HCV RNA复制的抑制能力加强，延长了STAT1的酪氨酸磷酸化作用，并且增加了IFN诱导基因的表达水平，从而提高IFN抗HCV的效应。机体高水平表达USP18的CHB患者对后期IFN治疗容易产生应答不佳，可以作为早期预测IFN应答疗效的依据，对于可能存在IFN应答不佳的患者做出治疗方案的更改和完善，既可以提高IFN治疗有效率，又为患者争取更多的治疗时间和机会。

四、展望

目前针对IFNα治疗CHB应答不佳的患者，提出应用一种新型干扰素-IFNλ。IFNλ是近年来发现的Ⅲ型IFN，IFNλ与IFNα信号途径相似，通过结合由广泛表达的白细胞介素-10R2和在特异细胞中表达的IFNLRI(白细胞介素28RA)组成的受体激活JAK-STAT信号通路进行信号传递。

大鼠反复多次注射IFN—α后于肝组织和消化道黏膜上皮高表达USP18并出现IFN信号传导明显减弱，但继续给予IFNλ注射后于消化道黏膜上皮细胞内可检测到高表达的磷酸化STATl和STAT2，表明仍有JAK-STAT经典IFN信号传导途径的激活，以上实验结果提示由于体内高水平表达USP18而导致对IFN α治疗应答不佳的CHB患者，IFNλ有可能成为被选择的IFN抗病毒治疗方案。

基于USPl8对lFN信号途径的负性调控作用，将来IFN联合USP18的抑制剂，有望成为IFN抵抗CHB患者抗病毒治疗的新手段。

文章摘自《中华肝脏病杂志》2014年第22卷第5期